开发旅游软件的公司 Nature Commun.丨重磅! DropBlot——一种化学固定单细胞卵白质组分析的混杂微流控平台
辩论先容开发旅游软件的公司
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辩论布景
Background
生物样本库和医疗中心存有大批归档肿瘤组织，这些组织对交融疾病和开导疗法极端重要。为保存细胞样子和阻碍卵白质降解，归档组织频繁进行化学固定，细胞固定是临床病理学和生物医学辩论的枢纽部分。
可是，现存分析时期如免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术和质谱等存在多样不及，举例免疫组织化学和免疫细胞化学只可陈说卵白质指地点存在、定位和散播；流式细胞术需要大批细胞且检测特异性有限；质谱在单细胞检测方面存在艰苦且不适用于统共卵白质联系问题；平板凝胶免疫思路诚然是一种靶向卵白质组学法式，但传统的怒放微流控芯片蓄意不适用于固定细胞的制备。
微流控时期在固定细胞的样本制备中具有上风，基于液滴和反馈室的微流控系统可为细胞孵育、裂解和抗原索求提供顽固环境，有助于分析不同类型的细胞和多种固定条款。
在分析生物样本库中归档的样本时，需要在晋升检测贤惠度和特异性的同期，减少对稀缺样本的滥用，这恰是该辩论的需求所在。
辩论办法
Objectives
引入一种用于化学固定单细胞卵白质组分析的混杂微流控平台DropBlot，以措置现存单细胞分辨率卵白质组分析器用在特异性和贤惠度方面的不及，同期粗略特殊的归档生物样本。
提供符合卵白质亚型和卵白质复合物分析的靶特异性，以措置很多这类卵白质靶点缺少特定抗体探针的问题。
欺诈DropBlot分析患者起首的肿瘤细胞样本，真切了解肿瘤细胞中卵白质抒发的异质性，为癌症辩论和调理提供新的看法和法式。
辩论重心
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app辩论过程
一.责任旨趣轮廓及枢纽
DropBlot是一种用于化学固定单细胞卵白质组分析的混杂微流控平台，通过微流体H - 型勾通点产生水包油（W/O）液滴，将单个固定细胞与含有名义活性剂的抗原索求缓冲液共封装在液滴中。
DropBlot通过 液滴时期达成了对 单个固定细胞的抗原索求，然后通过 怒放流体芯片进行单细胞PAGE和免疫思路，从而达成了对 化学固定单细胞卵白质组的分析。
图1 DropBlot的蓄意、操作和坚毅
二.蓄意液滴及优化
在遴荐W/O化学物资和液滴生成条款时，需要磋商多种身分，以确保液滴省略在尖刻的抗原索求条款下保捏踏实，同期达成充足的抗原融解和最小化的抗原泄漏。
优化后深信了踏实的的液滴配方后是将 固定细胞在液滴中于98°C下孵育60 - 120分钟，以达成 抗原索求。
在监测时期荧光强度莫得显贵下落，布景强度险些 保捏恒定，况且单个液滴的强度散播在实践前后莫得显贵相反，这标明 该液滴配方省略有用地保存指标卵白质。
图2 蓄意和产生固定细胞裂解和抗原索求所需的踏实液滴，将液滴装入各个微孔以电震动到裂解的PAGE。
图3 卵白质靶向电震动从微孔封装的W/0液滴到联络的PAGE凝胶的模拟和考证
将含有细胞裂解物的液滴千里降到怒放流体芯片的微阱阵列中，然后通过电震动将融解的卵白质指标从每个微阱封装的液滴注入到临近的聚丙烯酰胺凝胶中，进行卵白质分离。
在电震动过程中，通过数值模拟和实践考证了卵白质从液滴到凝胶的打针扫尾和分散情况。
在合适的条款下，卵白质省略从液滴中得胜电震动到凝胶中，并在PAGE过程中达成存效的迁徙和分离。
完成PAGE后，通过光拿获将卵白质固定在凝胶中，然后进行免疫思路和荧光成像检测。使用特定的抗体探针与卵白质指标勾通，通过荧光信号检测卵白质的抒发情况。
通过对不同细胞系和卵白质指地点分析，考证了DropBlot在单细胞卵白质组分析中的有用性和特异性。
图4 使用纯化卵白圭臬品进行DropBlot分析
三.检测未固定癌细胞样本
测试DropBlot的样本制备和整合功能，软件定制开发评估抗原 - 检索缓冲液（包括SDS）与检索抗原的免疫反馈性之间的关系。
DropBlot系统适用于分析未固定单细胞的卵白质指标，省略辨别不同细胞系中基于独有指纹卵白质和卵白亚型的相反。
图5 欺诈两个未固定的乳腺癌细胞系 MCF7和MDA-MB-231的单细胞进行 DropBlot分析
四.测试固定的癌细胞样本
1.PFA固定的癌细胞
通过DropBlot时期，从PFA固定的癌细胞系 （MCF7和MDA - MB - 231）中得胜检测到卵白质指标。 与崭新癌细胞系比拟，从PFA固定细胞中索求的卵白质指标在PAGE中的 电泳迁徙速率约慢50% ，这是因为PFA固定酿成的新共价分子键使卵白质的斯托克斯半径增大，电泳迁徙率镌汰。 加多PFA固定时刻（从15分钟加多到30分钟）和抗原检索孵育时刻（加多到120分钟）会显贵减少可检测到的卵白质峰的数目和强度。
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和值分析(注：和值中心点为810)：上期奖号和值开出大数893，在历史已开出的1299期奖号中，大数和值出现652次，小数和值出现641次，中心点和值810出现6次，走势基本相当；最近20期大小数和值都出现了10次，表现平衡，前5期和值走势为：升、升、降、降、升，本期注意和值转向下降，出现在620周围。
2. 甲醇固定的癌细胞：
EpCAM检测 ：使用DropBlot对甲醇固定的MCF7细胞进分析，诚然 EpCAM可被检测到，但电泳迁徙速率比PFA固定的细胞更慢 。
卵白质聚首 ：不雅察到卵白质信号在微阱近邻升高，存在 大卵白质二聚体分子或卵白质聚首 。
卵白亚型分析：通过比较MCF7和MDA - MB - 231细胞中EpCAM和VIM的卵白亚型散播。
电震动扫尾：PFA固定细胞中卵白质指地点电震动扫尾规模为73.2%至84.8%，甲醇固定细胞中为44.4%至49.3%。
说七说八，DropBlot适用于分析PFA和甲醇固定细胞中的卵白质指标，但关于甲醇固定细胞中不溶性卵白质指地点减少，可能需要进一步优化。
图6 使用单个PFA和甲醇固定的癌细胞进行DropBlot分析
辩论亮点
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DropBlot的时期上风包括以下几点：
1. 适用于固定细胞分析：省略对化学固定的单细胞进行卵白质组分析，措置了传统怒放微流控芯片蓄意不适用于固定细胞制备的问题。
2. 特异性符合卵白质亚型和复合物分析：提供了符合卵白质亚型和卵白质复合物的靶特异性，且很多这类卵白质靶点缺少特定的抗体探针。
3. 粗略特殊的归档生物样本：领受微流控蓄意，比拟于平板凝胶测定模样，省略减少对稀缺的归档固定生物样本的滥用。
4. 省略分析卵白质亚型：不错分辨不同细胞类型基于其独有指纹卵白质和卵白质亚型的相反，举例在分析乳腺癌细胞系时，省略辨别上皮细胞系和间充质细胞系中卵白质的抒发相反。
5. 检测细胞亚群：通过“细胞门控”模式，省略分析特定细胞亚群中卵白质亚型的抒发情况，如同流式细胞术相通，但在分析卵白质亚型方面具有独有上风，是流式细胞术或其他现存单细胞免疫测定无法达成的。
6. 潜在的膨胀性：可整合已成就的样本制备时期以检测稀有细胞，扩大指标检测多路复用，以及篡改从FFPE细胞样本中进行抗原检索等。
辩论论断
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DropBlot 不错为特殊生物样本库的单细胞分辨率卵白质生物符号物挖掘提供精准的集成责任经由。DropBlot省略从PFA和甲醇固定的细胞平分析卵白质，具有检测生物样本中有限细胞和卵白质亚型的后劲，但仍需要进一步优化和篡改。
参考文件
[1] Liu Y, Herr AE. DropBlot: single-cell western blotting of chemically fixed cancer cells. bioRxiv [Preprint]. 2023 Sep 6:2023.09.04.556277. doi: 10.1101/2023.09.04.556277. PMID: 37732260; PMCID: PMC10508777.
END
案牍 | 赵梦溪
排版 | 赵梦溪
审核 | 赵梦溪
发布｜姜笑南
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